近日，yl9193永利集团赵雪/赵新锋在国际药物分析/分析化学权威杂志Analytical Chemistry（中科院1区Top）在线发表了题为“Affinity-Driven Two-Step Immobilization of Endogenous Natural GABAA Receptor to Quantify Drug-Protein Analysis with Enhanced Sensitivity and Accuracy”的研究论文。该研究以天然态药靶蛋白GABAA受体为核心，重点开展了基于配体导向-点击反应的GABAA受体固定化新方法及评价研究，实现了细胞内天然态GABAA受体的高活性固定，显著提升了固定化受体-药物相互作用分析方法的灵敏度与准确性，为其他天然态药靶蛋白亲和分析方法的建立提供了方法学借鉴。

药靶蛋白高活性固定化方法的建立是构建生物传感器、亲和色谱等分析方法检测灵敏度、选择性和准确性的关键。然而，现有药靶蛋白固定化技术主要依赖于纯化或重组蛋白，缺乏直接从活细胞中捕获低丰度内源天然药靶蛋白的有效策略。针对这一问题，赵雪/赵新锋在前期研究基础上（Anal. Chem. 2025, 97(18):10046-10055），聚焦GABAA受体，以其经典配体Afloqualone为亲和识别模块，通过二者的特异性识别与结合，将酰基咪唑基活化的配体衍生物（AfloAI）导向至GABAA受体配体结合域附近，借助AfloAI亲电基团与结合域附近亲核氨基酸残基的酰基取代反应及AfloAI自身炔烃基团与固体界面叠氮基团间的环辛炔-叠氮环加成反应，实现了细胞内天然态GABAA受体的快速、高活性固定。

图1 亲和导向两步法固定天然态GABAA受体示意图

小鼠海马神经元细胞（HT22）中验证了该方法的靶向标记活性与特异性。荧光成像与pull-down分析结果均证实该方法能特异性地标记细胞膜上的GABAA受体。

图2 亲和导向两步法标记活细胞天然态GABAA受体

用上述方法制备了固定化天然态GABAA受体的SPR传感芯片和色谱固定相。由于固定化蛋白质活性高、稳定性好，在分析药物-受体的相互作用时，其检测灵敏度比固定化重组受体芯片提高了~3.5倍，测定的亲和力（KD值）提升了~10倍。色谱分析结果显示，与重组受体相比，天然GABAA对配体的选择性、分离度和检测灵敏度分别提升了~10倍、~3.2倍和~10倍。

图3 固定化内源天然态GABAA受体增强SPR检测灵敏度

图4 固定化天然态GABAA受体提高色谱性能

本研究建立的方法无需对目标蛋白进行纯化或重组，即可实现内源性低丰度天然药靶蛋白的选择性固定。该方法成功地将固定化药靶蛋白分析平台从传统重组或纯化蛋白层次推进至内源天然蛋白，为在生理环境下开发高灵敏度、高准确性的生物分析平台提供了潜在的通用方法，在药物筛选与靶点鉴定领域具有广阔的应用前景。

作者团队

yl9193永利集团师资博士后赵雪为论文第一作者。yl9193永利集团张亚军副教授和赵新锋教授为共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金面上项目(22374116；82174088)、国家资助博士后研究人员计划项目（GZC20241385）和陕西省博士后科研项目（2023BSHEDZZ229）的资助。

全文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05899